三维打印在软骨组织工程中的应用

作者：于淑颖 李昱 程新好 张怡君 刘铮 闫成祥 谢百慧 王喜梅
来源：《中华整形外科杂志》2024年01月 第40卷 第01期
作者单位：郑州大学第一附属医院整形外科， 郑州450000
通信作者：王喜梅，Email:tracywang@zzu.edu.cn
      在过去的几十年中，软骨的再生已经取得了巨大的进展。传统构建组织工程软骨支架的技术主要包括孔剂法(或模板法)、相分离法、气体发泡法、冷冻干燥法、静电纺丝法等。软骨是异质性的，传统支架很难模拟软骨的高度各向异性结构。因此，软骨的功能再生具有挑战性。随着三维打印技术的进步，通过生物材料、细胞和活性生物分子的共沉积，使制备精细结构、梯度变化的功能性仿生支架成为可能，从而实现功能性软骨再生。该文详细阐述了三维打印技术及其在不同解剖位置(关节、耳廓、鼻)软骨再生中的应用。此外，还讨论了制备具有区域结构梯度和区域成分梯度的仿生构建体的重要性。三维生物打印、四维打印技术及智能材料为仿生组织和器官的构建带来了希望。
       软骨组织工程是集材料学、细胞生物学、工程学等多学科的研究领域，随着材料科学、细胞生物学以及三维打印技术等的不断进步，近几十年来软骨组织工程也得到了飞速的发展 [ 1 ]。软骨组织工程包括支架、种子细胞和生长因子3个经典要素 [ 2 ]，该技术主要是利用自体软骨细胞或成体干细胞作为种子细胞，将种子细胞接种在具有三维多孔结构的生物可降解支架材料上，种子细胞在生长因子的指导作用下，经过适当的分化调节，形成软骨或软骨样组织 [ 3 ]。软骨支架为种子细胞的扩散和增殖提供支撑作用，也为软骨及软骨样组织的再生和重建提供有利空间，在软骨组织工程中占据至关重要的位置。理想的软骨组织工程支架材料应具有以下几个特性：(1)生物相容性，支持种植于其上的种子细胞增殖、分化、成熟；(2)可降解性，支架置入后随着时间的推移可以缓慢降解，并促进细胞产生新的软骨基质取代支架材料，以便再生软骨组织将其取代 [ 4 ]；(3)生物力学性能，能稳定维持软骨的形状，具有与要修复软骨组织一致的机械性能；(4)个性化，支架的外形应当与修复区域匹配，或易于被塑造成各种所需的形状；(5)适当的孔隙率，允许分子、营养物和氧气的迁移和扩散 [ 5 ]。
       传统的软骨支架制备方法包括孔剂法(或模板法)、相分离法、气体发泡法、冷冻干燥法、静电纺丝法等，具有简便、经济等优点，但是也存在着难以灵活设计和精确调控支架的微观结构、难以个性化制造与损伤部位高度契合的支架外形、难以构建非均匀特征的支架(双相及多相支架)等缺点。近年来，三维打印技术发展迅速，在计算机辅助成型的基础上能够精准构建和调控支架的宏观外形与微观特征，形成具有良好相容性、形态和力学强度适宜的软骨仿生梯度支架，最终达成软骨及软骨样组织的个性化修复与再生 [ 6 , 7 ]。因此，三维打印技术在软骨组织工程领域中的应用有着广阔的发展前景。本文详细介绍了软骨组织工程的种子细胞、支架材料、三维打印技术，以及三维打印技术在不同解剖位置(关节软骨、耳廓、鼻)软骨再生中的应用。此外，还讨论了具有区域结构梯度和区域成分梯度的仿生构建体的制备方法，三维生物打印技术、四维打印、智能材料为仿生组织和器官的构建带来了希望。

一、三维打印技术
(一)三维打印技术的几种方式
三维打印技术是一种快速成型技术，又称增材制造，是以数字模型文件为基础，运用粉末状金属或塑料等可粘合材料，通过逐层打印的方式来构造物体的技术 [ 1 ]。通过结合CT、MRI、表面扫描和三维摄影等成像技术，利用计算机辅助设计(computer-aided design，CAD)和计算机辅助制造(computer-aided manufacturing，CAM)技术，将目标软骨形状数据转化为三维打印数字模型文件，再经由三维打印技术精确定制软骨结构外形，获得理想的组织工程软骨。常见的三维打印方式包括：熔融沉积技术(fused deposition modeling, FDM)、立体光刻法、低温沉积制造(low-temperature deposition modeling, LDM)、选择性激光烧结(selective laser sintering, SLS)、三维打印成型(three-dimensional printing, 3DP)、电子束自由成型制造(electron beam freeform fabrication, EBF)、直接金属激光烧结(direct metal laser sintering, DMLS)、电子束熔化成型(electron beam melting, EBM)、选择性激光熔化成型( selective laser melting, SLM)、选择性热烧结(selective heat sintering, SHS)等 [ 8 , 9 ]。下面主要介绍FDM、立体光刻法、LDM及SLS。

1．FDM
FDM是最常用的三维打印技术。FDM原理是在计算机精准控制路径中，高温熔融挤出聚合物材料流经喷嘴后，材料在逐层打印过程中形成适当的形状( 图1 )。FDM可以快速制造具有高度互连的孔几何结构和通道尺寸的支架。通过改变挤出压力、喷嘴直径和沉积速度等工艺参数，可以打印具有宽范围细丝直径和孔隙率的支架。FDM通常适用于聚己内酯(polycaprolactone, PCL)、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸等热塑性高分子的成型以及少数温敏材料的打印，其特点是材料加工应用灵活，打印的结构精度高、支架力学强度较为理想，可构建多种软骨支架，在三维打印中广泛应用。但由于FDM加工温度高，FDM的材料处于受热状态，细胞无法在打印过程存活，不适用于生物打印 [ 8 ]。

2．立体光刻法
立体光刻法包括光固化(stereolithography, SLA)和数字光处理(digital light processing，DLP) 技术，是感光性材料经光源照射后迅速发生固化，逐层沉积，最终实现三维打印成型。立体光刻法不是基于喷嘴方式，而是液体材料位于树脂浴中，其中构建板降低并且光源跟踪编程图案仅交联设计的部分，该过程可逐层让材料沉积，直到物体成型完成 [ 10 ]，它避免了在其他技术中通常观察到的细胞上的剪切应力。SLA和DLP技术间的区别是使用的光源不同，SLA使用激光，而DLP使用来自投影的光源。激光系统逐点诱导光敏材料的选择性交联，而DLP系统使用动态反射镜阵列，选择性地将光投射到区域中，以交叉链接分配给每个层的所有点 [ 11 ]。SLA或DLP基于光敏聚合物原料，可以获得较高的结构精度和稳定性，并且SLA立体成型成熟度最高，成型速度快，尺寸精度高，适用于光敏水凝胶(如双键改性的明胶和透明质酸)构建软骨支架和生物打印。常用的感光性水凝胶材料如甲基丙烯酸化的藻酸盐、明胶、聚乙二醇等可用于软骨组织工程构建 [ 12 ]。

3．LDM
LDM在受控的冷却室的作用下，使复合浆料或溶液在沉积过程中始终保持低温状态 [ 13 ]。LDM适用于高分子浆料、混合生物材料和聚合物的打印，可实现高精度复合浆料沉积，并且可以通过冷冻干燥在材料表面形成微孔，但是LDM可能会在构建体中残留有机溶剂 [ 9 ]。

4．SLS
SLS是一种在计算机控制下进行激光扫描，以在工作平台上熔化和粘结粉末材料的技术。当一层扫描完成后，在固化层的表面涂上一层新的粉末材料，对其进行扫描并逐层粘合，以产生三维结构。SLS主要适用于金属粉末、塑料和陶瓷的打印。SLS无需使用支撑材料，加工速度快，但是持续高温可能会导致聚合物材料降解，产品表面粗糙且需要后处理，加工过程中会产生灰尘和有毒气体。因此，SLS不适用于水凝胶成型 [ 9 ]。

(二)三维生物打印
三维生物打印是众多三维打印技术中的一个分支，也是组织工程和再生医学的一种先进辅助技术手段 [ 14 , 15 ]。目前三维打印技术广泛应用于软骨支架的打印，由于材料特性以及成型条件限制，需要在软骨支架打印成型后接种种子细胞。而三维生物打印以活体细胞与支架材料为生物墨水进行同步打印，最终形成具有生理功能的组织或器官。传统三维打印技术无法精准调控接种在软骨支架上种子细胞的空间分布，所构建的微环境与体内差异大。三维生物打印弥补了传统三维打印的缺点，精细控制细胞分布以及机械、化学性质的调节，可以更好地模拟天然软骨的解剖结构及其生理功能 [ 9 , 16 ]。这开辟了许多新的视角，包括通过开发复杂结构(如骨软骨隔室)、不同类型的软骨(透明软骨、纤维软骨、弹性软骨)和根据特定患者的需要，构建个性化医疗。三维生物打印的关键要素在于生物墨水的设计，传统三维打印软骨支架时，由于没有活体细胞的存在，可选择的打印方式较多，打印条件可较为苛刻，如冷冻、加热、高强度光交联等；传统三维打印可选择的打印墨水较为宽泛，如水凝胶的水相溶液、热塑性高分子的有机溶液或熔融浆料；传统三维打印可控制的打印墨水的参数自由度较大，可最大限度提高支架材料的浓度和黏度以获取更加理想的结构成型效果。而三维生物打印由于生物墨水中活细胞的存在，为保持细胞的生物活性，可选择的打印方式较少，生物墨水的制备和打印也需避免苛刻的环境；由于水凝胶十分接近天然细胞外基质(extracellular matrix, ECM),细胞可以在水凝胶内部存活，因此水凝胶是目前制备生物墨水的最主要材料 [ 17 , 18 ]。三维生物打印成型性能(与结构相关)和细胞活性(与功能相关)对于生物墨水的特性(如黏度、强度等)有着相反的要求，前者希望生物墨水有较高的浓度、交联密度等，后者正好相反。由于单种水凝胶存在各自的缺陷，复合生物墨水体系已成为软骨生物打印的主流。目前，三维生物打印技术还处于发展阶段，适宜的生物墨水较少是限制其发展的重要原因之一，开发更多可供选择的生物墨水是目前三维生物打印技术重要的研究方向 [ 19 , 20 ]。

二、三维打印技术在关节软骨的应用
（一)关节骨软骨解剖结构和功能
骨软骨组织构造精细且复杂，在解剖结构上关节软骨与软骨下骨互相连接，具有特定的骨软骨单元结构梯度和生物学特性。骨软骨界面是一个呈连续性变化的整体，由上而下软骨组织具有不同的微观解剖结构、力学特性以及生物学特性 [ 21 ]。在微观解剖学中，关节软骨自上而下可分为3层：关节软骨层、钙化软骨层和软骨下骨层( 图2 )。其中关节软骨层包括软骨表层、中层和深层。关节软骨层又称透明软骨层，透明软骨层和钙化软骨层交界区被称作潮线，它是嵌合在软骨深层与钙化软骨层中的一个彼此交错的三维结构，将较软的透明软骨组织与较硬的钙化软骨连接在一起。钙化软骨层和软骨下骨层的交界区被称作水泥线或粘合线，将两侧结构交错结合锚定在一起。

关节软骨层主要由水、ECM(主要是Ⅱ型胶原纤维)和软骨细胞组成。胶原纤维直径和方向、各层含水量、细胞形态和种类等由软骨表层至深层逐渐发生变化。胶原纤维在软骨表层直径较细、排列密集、与关节表面相平行；在软骨中层，直径增粗、排列随意；在软骨深层，胶原纤维直径进一步增粗、与关节表面相垂直，部分来自软骨深层的粗大胶原纤维贯穿潮线将软骨深层与钙化软骨层紧紧连接。含水量在软骨表层最高，随着深度的增加逐渐降低，软骨深层含水量最低。由于含水量与渗透率呈正相关，软骨深层渗透率最低，几乎没有液体能够通过该组织，因此该层受到的界面剪切力也最大。

钙化软骨层是位于关节软骨层与软骨下骨层之间的一层钙化骨组织，是一种天然界层结构。钙化软骨层软骨细胞含量、含水量进一步降低，同时出现组织钙化。软骨的抗压模量和抗压强度从表层到深部逐渐增加，钙化软骨层形态致密，其硬度为关节软骨层的10倍，为软骨下骨层的1/60。在力学性能方面，钙化软骨层起承载多变剪切力、缓冲力以及连接作用，使得关节在运动时受的力学冲击显著降低，并且将关节软骨的剪切力转化为压应力传递至软骨下骨，大大降低了关节软骨被压碎和撕裂的可能性。另外，钙化软骨层有屏障作用，阻碍了关节软骨层与软骨下骨层之间的物质交换 [ 22 ]。

软骨下骨层由水(约10%)、透明质酸、糖蛋白(Ⅰ型和Ⅴ型胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白)和矿物质成分组成。软骨下骨是高度血管化的生物矿化结缔组织，大量的透明质酸和Ⅰ型胶原纤维为软骨下骨提供了强大的抗压强度和强大的硬度，与软骨相比，软骨下骨具有更高的压缩模量和更低的弹性模量。

(二)三维打印技术方案
整体来看，关节软骨自上而下含水率逐渐降低，蛋白多糖以及钙化程度逐渐升高。正因为关节软骨有很强的层次递进性，从而导致了其具有独特的生物学特性和结构复杂性 [ 23 ]。而三维打印技术逐层组装的特点使得种子细胞、生物活性因子和生物材料在三维空间中可以精准排列分布 [ 24 ]。此外，由于软骨损伤的同时往往伴有软骨下骨的损伤，三维打印技术可用于制造具有细胞梯度及排列结构的软骨支架，因此在构建双相及多相仿生支架时具有极大优势。目前常见的软骨支架可分为离散型仿生支架和连续型仿生支架。离散型仿生支架又可分为单相支架、双相支架和多相支架等 [ 25 ]。

单相支架由一种或多种材料制备而成，具有相同结构、成分、力学属性，其单一的孔径率和机械性能无法满足关节软骨渐变的组织结构和功能变化的要求。双相支架通常具有软骨相和骨相2层结构，且各分层在成分、结构、力学性能上更加接近软骨组织结构，能够一定程度上构建软骨-骨一体化修复 [ 26 ]。Swieszkowski等 [ 27 ]使用了由纤维蛋白/PCL和PCL/PCL-磷酸三钙相组成的双相结构。这2个结构接种适当数量的细胞，分别用于软骨和骨再生的成软骨培养基和成骨培养基。最后，使用纤维蛋白胶将2个结构整合成1个构建体，可以清楚观察到软骨再生和新骨形成。但是双相软骨支架缺少了钙化软骨层，且支架置入后有支架断裂等并发症，所以三相及多相支架在软骨-骨一体化修复中有更大优势。三相及多相支架能够更好地模拟出天然软骨的分层结构及力学性能上的变化，从而构建出理想的仿生软骨。Du等 [ 28 ]使用SLS技术制备了由PCL和透明质酸/PCL微球组成的多相骨软骨支架，该仿生支架具有连续多层结构，模拟了从关节软骨层到软骨下骨层的梯度组成变化。结果表明，多相支架具有高度互连的孔隙率和理想的机械性能，以及优异的生物相容性。动物实验的体内评估进一步证实，多相支架可成功诱导骨软骨修复，新形成的组织表现出多种组织类型，包括关节软骨和软骨下骨。相较于离散型骨软骨支架，连续型仿生软骨支架显著降低了支架分离等并发症的发生，连续型仿生软骨支架可将各层成分、结构、力学性能逐渐平稳过渡，通过一体化构造增强了支架的稳定性 [ 29 ]。Gao等 [ 30 ]通过双氢键单体、N-丙烯酰甘氨酸酰胺(NAGA)和N-[三(羟甲基)甲基]丙烯酰胺(THMMA)共聚合成了高强度热响应超分子共聚物水凝胶。NAGA/THMMA共聚单体水凝胶(PNT水凝胶)显示出温度敏感的可逆凝胶↔溶胶转变和剪切减薄行为，因此可通过三维生物打印制备具有梯度成分(顶层加载转化生长因子β1，底层结合β-磷酸三钙)的连续型仿生软骨支架，所得梯度支架保持高保真度和分辨率，具有高度互连的孔隙和理想的机械性能以及优异的生物相容性。此外，这种在不同层上印刷有转化生长因子β1和β-磷酸三钙的生物杂交梯度水凝胶的支架有助于体外人骨髓干细胞的附着、扩散、成软骨和成骨分化。

三、三维打印技术在耳廓软骨的应用
软骨主要以3种形式存在于身体中：弹性软骨、纤维软骨和透明软骨。尽管3种软骨的特征都是高含水量和由软骨细胞支撑、维持，但是其富含Ⅱ型胶原和糖胺聚糖的ECM之间存在显著差异，因此每种类型的软骨都具有不同的功能。例如，位于外耳和会厌的弹性软骨具有富含弹性蛋白的ECM，该ECM为组织提供弹性，其主要功能是在重复弯曲时提供支撑，同时保持结构和形状。在耳廓弹性软骨中，由于不同部位的ECM含量分布不同，造成各部位力学性能的差异 [ 31 ]。耳软骨ECM主要由蛋白多糖和弹性纤维构成，其中耳廓软骨中央区域弹性纤维分布密集，周边区域分布稀疏，因此耳廓中的耳屏、耳轮、对耳屏、对耳轮、耳甲和耳舟等亚单位结构( 图3 )具有不同的力学性能，其中耳轮力学强度最低，对耳屏力学强度最高。耳廓软骨无血管、低浓度的细胞以及固有的不增殖特性使该软骨无法在功能、组织上自我愈合或再生 [ 32 ]。

先天性小耳畸形、耳廓外伤、耳廓术后、耳廓炎症等各种原因可导致耳廓软骨不同程度的缺损。耳廓软骨缺损可影响其生理功能、颜面美观，严重者可危及患者心理健康，因此耳廓软骨缺损修复重建对提高患者生活质量具有重要意义。耳廓软骨组织工程早在20年前已成功开展，Cao等 [ 33 ]将牛软骨细胞接种在非织造聚乙醇酸网上，用海藻酸钠模具通过溶剂浇铸工艺将其进一步嵌入聚乳酸中，从而创造了人工耳。将构建体植入无胸腺小鼠皮下，12周后它们表现出新软骨的大体组织学外观。但是通过传统工艺制造的耳软骨支架在植入体内时发生坍塌，这也是此软骨支架的致命弱点。发展与天然耳廓软骨不同解剖分区的力学性能相适应、结构精细并可长期稳定于体内的耳软骨支架，是组织工程耳软骨研究和临床转化迫切需要解决的关键问题。

三维打印技术在制备复杂形状和多种细胞类型的耳廓软骨支架中广泛应用。Xia等 [ 34 ]将明胶和透明质酸制备成水凝胶，并采用三维打印以确保外部三维形状和内部孔隙结构的精确控制；其次，将甲基丙烯酸酐和光引发剂引入水凝胶系统，以使材料在三维打印期间可光固化；最后，采用冷冻干燥进一步提高机械性能并延长降解时间。通过整合光固化三维打印和冷冻干燥技术，以明胶和透明质酸成功地制成了人耳形状的支架，与原始数字模型相比，这种支架的形状相似程度超过90%。最重要的是，与软骨细胞结合的支架在体外和自体山羊模型中成功地再生了具有典型腔隙结构和软骨特异性ECM的成熟软骨，这充分表明了光固化三维打印技术特别适合于制造具有精确、复杂、高质量、个性化的天然支架。Zopf等 [ 35 ]利用基于激光烧结的三维打印技术，以PCL作为耳廓重建的原材料，制备患者专用支架，结果显示制备的耳廓支架具有高保真度和精细微孔结构，并支持软骨再生。生物打印技术能够精确沉积生物材料、种子细胞和生物因子，且允许支架内的材料和细胞发生变化。近年来，三维生物打印技术的发展推动了耳廓软骨支架的进一步进展。Jang等 [ 36 ]以PCL和含有脂肪干细胞、软骨细胞混合物的细胞负载藻酸盐水凝胶为生物墨水，通过三维生物打印技术进行耳廓框架的精准构建，该耳廓支架具有高度的孔隙率、适当的孔径、高度增强的机械性能，以及与天然耳廓软骨相似的细胞梯度。用定量和定性方法评估体外细胞活力、增殖和分化，结果均表明，软骨细胞、脂肪干细胞在三维支架中共培养后促进软骨生成。此外，使用大鼠模型进行了体内组织学分析，显示该耳廓支架在体内存活良好、无移位、无炎症反应，并且可再生出相应区域的丰富的腔隙软骨细胞和大面积的成熟软骨。这些研究均表明，快速发展的三维打印技术使构建精细结构、与天然耳廓软骨不同解剖分区力学性能相适应的天然仿生软骨支架有望实现。

四、三维打印技术在鼻软骨的应用
鼻是人类面部最突出的器官，包括支架结构、支撑系统及外覆组织。支架结构包括骨和软骨，其由结缔组织和韧带连接到一起并发挥支撑作用。皮肤及软组织覆盖于其表面。先天性畸形、外伤、烧伤、鼻部术后均可导致鼻部软骨缺损，极大影响患者的生活质量及心理健康。鼻部软骨部分包括鼻中隔软骨、鼻翼软骨以及侧鼻软骨( 图4 )，占据鼻部的2/3。鼻翼软骨是构成鼻下部1/3的主要成分，其轮廓决定着鼻尖的固有特征，鼻翼软骨与侧鼻软骨、鼻中隔软骨之间的相互连接与鼻尖部的支撑、位置、轮廓密切相关，共同构建了鼻部重要的美学尺度。因此，鼻重建和鼻软骨再生一直是一项艰巨的挑战。过去20年中，组织工程取得了巨大进展，但大多数研究的结果都是形状不规则的软骨珠，不够精确 [ 37 ]。

三维打印技术基于患者的CT图像数据或三维全息显示进行术前鼻模拟，根据患者要求，精确确定鼻形状、体积、鼻背高度、鼻翼曲率、鼻尖高度等细节，借助三维打印技术(包括CAD/CAM)生产定制精确、复杂的鼻软骨形状 [ 38 ]。此外，传统的人工鼻置入物永久存在于患者体内，会导致感染和免疫反应等并发症。三维打印鼻置入物由选定的可生物降解材料制成，减少了并发症发生，是隆鼻术的合适移植物 [ 39 ]。选择和定制合适的材料从功能和美学上重建鼻是确保手术成功的关键。目前，PCL已成为组织工程领域的一种适用聚合物，因为它具有生物相容性，在体内可安全分解(超过3～4年)。PCL也非常适合在三维打印技术中用作支架或植入物 [ 40 ]。它在60 ℃熔化，而不需要有毒溶剂溶解，可以在计算机控制的模式挤出以逐层构建结构。这些特性可以使其有效地用于设计和定制患者个性化的部件。Park等 [ 41 ]证实PCL易于使用，可避免手术时间增加和发生相关并发症，大体形态学观察显示，兔术前的钝鼻外观变为锐利而精致的外观，矫正效果可保持12周。三维打印的PCL鼻支架显示出优异的生物相容性和形状保持性，可作为鼻整形和颅面重建的临床生物相容性材料。然而，一些可生物降解并获得美国食品和药物监督管理局批准的支架材料并不具有鼻硅胶置入物的柔韧性，因此会发生挤压、感染、外露等风险 [ 42 ]。评估支架材料在体内是否具有完全的生物相容性是一个严格和长期的过程，新生物材料很难获得临床应用的批准。改变支架的结构来提高支架的灵活性是一个新思路。Jung等 [ 43 ]使用基于投影的微立体光刻和牺牲模塑，制造了具有相同孔隙率和相同晶胞尺寸的八面体、立方体或晶格孔结构的支架，并使用压缩和三点弯曲试验分析了其力学行为。与其他孔隙类型相比，八面体孔隙结构具有优异的柔韧性，在置入鼻子后可保持其机械稳定性。

在鼻软骨生物三维打印中，喷墨打印和挤出打印是最常用的技术，水凝胶作为一种含水量高的三维高分子网络，其在结构上模拟ECM，为细胞生长提供"支架"，是生物三维打印常用的墨水材料 [ 44 ]。作为载体材料，水凝胶的性质决定了生物三维打印的成败与质量，其需要具有良好的可打印性并能为细胞生长提供适宜微环境。然而，普通水凝胶的交联网络不够均匀且缺乏能量耗散机制，机械性能较差，无法成为兼顾可打印性及生物相容性的"好用"生物墨水。理想的鼻软骨支架要求具有长期的结构稳定性。为了补偿水凝胶无法保持均匀的三维结构，纳米纤维素/海藻酸钠水凝胶作为一种新型生物墨水，结合了纳米纤维素的剪切变稀行为和海藻酸钠的快速交联能力，具有强大的稳定性和整合性，目前广泛用于鼻软骨重建 [ 45 , 46 , 47 ]。Möller等 [ 46 ]应用这种新型生物墨水，基于挤出型三维生物打印技术，成功打印出鼻软骨支架。该鼻软骨支架在小鼠体内植入60 d后显示出良好的机械稳定性，并观察到糖胺聚糖产量和鼻软骨细胞增殖的逐渐增加，免疫组化显示出明显的细胞增殖和人Ⅱ型胶原沉积，证实了三维生物打印的人细胞负载水凝胶构建体中的体内鼻软骨的生成。Apelgren等 [ 45 ]同样使用纳米纤维素、藻酸盐与人软骨细胞、人间充质干细胞结合，使用三维挤出式生物打印机制造构建体(5.0 mm×5.0 mm×1.2 mm)。生物打印后立即将构建体植入48只裸鼠的背部皮下，分别在30和60 d后进行形态学和免疫组织化学检查，结果显示构建体中的人鼻软骨细胞显示出良好的增殖能力，60 d后17.2%的表面积被增殖的软骨细胞覆盖。在包含软骨细胞和干细胞混合物的构建体中，可观察到软骨细胞合成的糖胺聚糖和Ⅱ型胶原含量增加。该研究表明，三维生物打印是一种有前途的人类软骨制作技术。此外，为了再现鼻软骨的多层异质结构并实现整个鼻再生，Jodat等 [ 48 ]用集成生物传感系统打印了双生物墨水的鼻状结构。该构建体由多层软质和硬质生物墨水组成，在生物相容性条件下实现气味感知，软骨细胞负载的三维生物打印软骨样结构带有电子嗅觉模拟生物传感器。由甲基丙烯酰化水凝胶和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯组成的光交联水凝胶生物墨水可以通过调节生物墨水的机械性能，形成一个机械稳定性强、生物相容度高的三维微环境，以支持软骨细胞的生长和分化。因此，可以优化由不同浓度水凝胶组成的具有硬、软机械性能的2种不同生物墨水，以模拟鼻软骨中天然ECM的机械性能，从而允许鼻软骨组织的形成。

五、未来与展望
综上所述，骨软骨组织结构非常复杂，骨软骨缺损的再生仍然是组织工程和整形外科的一个巨大挑战。目前，已经通过三维打印技术获得了软骨(关节软骨、半月板、椎间盘、耳廓、鼻)的三维模型和支架。然而，在制备各向异性软骨的功能构建体方面仍存在一些挑战。由于关节软骨、半月板和椎间盘位于人体的承重部位，因此其软骨支架需要具备一定机械强度。耳廓、鼻等软骨为防止植入后的吸收、变性和钙化，不仅需要一定的弹性，也需要一定的机械强度 [ 48 ]。在组织再生和修复期间，组分的区域梯度(如不同的细胞和生物活性分子)和结构区域梯度(如不同的孔径、微结构和材料硬度)影响细胞增殖、迁移和分化，以及构建体的机械性能。因此，探索如何制造不同的软骨结构和仿生梯度非常重要。传统三维打印技术可一定程度上模拟体内软骨的结构生理特点，但三维生物打印技术通过使用CAD/CAM技术的空间和时间控制沉积来实现外部形状、内部孔隙率、活性细胞分布的精确控制，从而为仿生软骨的制备提供更好的解决方案。但三维生物打印技术尚不成熟，需要进一步提高分辨率和准确性。当前我们应该聚焦于改进三维打印技术和支架材料，制造具有适当生物力学特性的构建体，并通过印刷来保证较高的细胞存活率和生物分子活性，才能确保仿生组织和器官的构建。软骨组织工程的发展趋势是将天然材料与合成材料相结合，以充分发挥各自的优势。目前已经成功开发许多共聚物，有望成为软骨重建的理想材料。选择具有适当生物力学特性、生物相容性和表面形态的支架是促进软骨形成的关键，科学家需要继续努力。

目前，四维打印和智能材料的出现为软骨组织工程打开了新渠道。四维打印特指对智能材料的三维打印制造。相较于传统的三维打印，四维打印增加了"时间"这一维度，它使得所打印物体的物理特性(例如形状、颜色、尺寸等)能够响应外界刺激(诸如温度、光、有机溶剂、湿度等) [ 49 ]。四维打印通过给静态打印结构赋予动态属性，在热、光、pH、水分、电和磁场等各种刺激下，打印物体的形状和(或)属性随着时间的推移会发生变化，从而可以将材料的三维打印加工拓展到复杂几何形状之外。近年来，随着智能材料和新型打印方法的快速发展，大大扩大了四维打印的范围 [ 50 , 51 ]。智能生物材料可以调节细胞行为，提供良好的组织修复和再生微环境，从而诱导软骨修复和再生。这一过程通过被动响应外源或内源性刺激，调整材料的结构和功能，以接近于天然软骨；或者通过主动提供生理生化、物理信号因子，来控制药物或生物活性因子的释放调节此过程。应用智能生物材料构建能够与细胞和生物活性因子结合的软骨组织工程支架，被认为是软骨修复和再生的有效和有前途的策略。然而，目前临床上使用的智能生物材料很少。事实上，只有5%的生命科学发现从学术环境中最终转化用于临床、新药、诊断或设备。因此，临床需求必须是开发用于关节软骨修复和再生的智能生物材料的基础。生物材料，甚至是惰性生物材料，可以改善与细胞和组织的相互作用，并通过先进的制造技术获得智能 [ 52 ]。科学家们更应该使智能生物材料与先进的制造技术(三维、四维打印技术)相结合，推进软骨组织工程的进展。