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双重交联海藻酸盐基热响应水凝胶作为3D打印生物墨水用于细胞球状体生长和释放

频道:3D打印新闻 日期: 浏览:

     帕特雷大学化学工程系George Pasparakis教授团队在《Carbohydrate Polymers》期刊上发表文章“Dually crosslinked injectable alginate-based graft copolymer thermoresponsive hydrogels as 3D printing bioinks for cell spheroid growth and release”,作者研究团队在这项研究中开发了一种基于海藻酸钠接枝共聚物的双交联网络,具有聚(n-异丙基丙烯酰胺-co-n-叔丁基丙烯酰胺)P(NIPAM-co-NtBAM)侧链,并对其作为一种剪切稀释软凝胶生物链接进行了研究。提出的生物墨水可以在温和的3D打印条件下形成任意几何形状。研究人员证明了所开发的生物墨水可以进一步用作生物打印墨水,并展示了其促进人类骨膜衍生细胞(hPDCs)在3D环境下生长和形成3D球体的能力。总之,由于生物链接具有热逆转其聚合物网络交联的能力,因此可以进一步用于细胞球体的快速恢复,这意味着它具有作为细胞球体形成模板的潜在用途,可用于3D生物制造。


WHAT—什么是双重交联注射型热响应水凝胶?

双重交联注射型热响应水凝胶是一种先进的生物材料,它结合了两种交联方式:物理交联(如离子交联)和化学交联(如热响应性疏水相互作用),使其具备在特定温度下可逆变化的特性。这种水凝胶设计为可注射,能够在体内或体外通过改变温度来调节其物理状态,从而在3D生物打印、药物递送、组织工程等领域有广泛的应用潜力。

WHY—为什么采用双重交联注射型热响应水凝胶作为3D打印生物墨水,用于细胞球状体的生长和释放?

双重交联机制提升了材料的机械强度和稳定性。注射型设计使其便于通过3D打印设备进行精确成型。热响应性质允许材料在温度变化下发生相变,有助于细胞球状体的形成和释放。材料对细胞友好,支持细胞生长和分化。适宜的物理化学环境促进细胞形成球状体。热响应性简化了细胞球状体的回收过程
HOW—研究团队提出一种基于海藻酸钠接枝共聚物的双重交联注射型热响应水凝胶,作为3D打印生物墨水,用于细胞球状体的生长和释放。

在本研究中,作者报道了一种基于海藻酸钠的双交联聚合物凝胶剂,该凝胶剂由富含疏水性共聚单体N-叔丁基丙烯酰胺[NaALG-g-P(NIPAM-co-NtBAM)]的聚(N-异丙基丙烯酰胺)的热响应侧链接枝。当加热到临界温度以上时,P(NIPAM-co-NtBAM)侧链的疏水结合诱导了第二次交联,导致增强水凝胶(方案1)。在加热后,海藻酸盐侧链的第一个离子交联网络放大了双交联网络的机械性能。

方案1 该示意图显示了用于形成和回收细胞球状体的可注射双交联海藻酸盐基水凝胶生物墨水及其在3D生物打印中的应用


NaALG-g-P在不同浓度Ca2+的存在下研究了水性体系阳离子。特别是,在冷热循环之后,以1°C/min的斜坡速率,频率为6.28 rad/s,在线性粘弹性状态下进行振荡剪切实验,将应变幅度保持在0.1%。更详细地了解Ca2+的影响图1显示了基于海藻酸盐/PNIPAM的系统的流变行为,所有六种配方的流变剪切振荡数据。在图1a的照片中可以看到三种f比不同的特征水凝胶的光学观察。

为了探究不同交联模式之间是否存在相互作用,过量的G′(ΔG′20–37)在20和37°C之间绘制在图1f中,揭示了热增稠效应对网络交联的贡献。ΔG′线性增加,二价阳离子浓度在临界f=0.03以下和以上不同,其中由于离子键合而出现弹性。在f>0.03Δ时,G′随f显著升高,揭示了离子键合和疏水缔合机制之间的协同作用。

图1 基于海藻酸盐/PNIPAM的系统的流变行为


另一个可能影响接枝共聚物双凝胶流变行为的可调因素是热响应贴纸的单体组成。图2比较了两种海藻酸钠/钙凝胶剂在NtBAM含量上不同的热响应。疏水性NtBAM从6 mol%增强到14 mol%的主要作用是Tg的位移降低温度约10°C。低于Tg对于两种凝胶剂,两个系统的储存模量相等,前提是网络是通过相同f的离子交联形成的。

图2 两种海藻酸钠/钙凝胶剂在NtBAM含量上不同的热响应


为了便于比较,还研究了没有附加离子交联的体系凝胶形成。研究了无钙体系的模量G′、G′′随角频率(ω)的函数,并在20°C(即低于Tg)时表现出类似液体的行为其中既不存在疏水相互作用,也不存在离子相互作用。在37°C时,NaALG-g-P(NIPAMx-co-NtBAMy)系统呈现较弱的凝胶状形成,这仅仅是由于基于PNIPAM的接枝链的疏水性,与NaALG-g-P(NIPAM相比)x-co-NtBAMy)/Ca2+其中两种相互作用(疏水性和离子性)共存,传递过大的交联密度。

图3 NaALG-g-P(NIPAM86-co-NtBAM14)(不含Ca2+)水凝胶呈现溶胶-凝胶相变


在所研究的整个温度范围内,离子交联网络的G′明显更高,在TTg处形成了更具弹性的水凝胶。为了进一步评估两种交联之间发生的协同效应,NaALG/Ca2+的流变行为还探索了(无接枝链)基水凝胶,并在与接枝共聚物相同的F和聚合物浓度下进行了比较。这些结果证明了图3b的数据所观察到的协同效应的合理性。

图4 NaALG-g-P(NIPAM86-co-NtBAM14)(不含Ca2+)水凝胶呈现溶胶-凝胶相变


聚合物基热响应水凝胶的一个重要方面是,在注射过程中剪切诱导的网络破坏(原位凝胶化)后,它在生理温度下恢复。因此,水凝胶/Ca2+样品在20°C(即在注射温度下)进行应变扫描预处理,远高于线性粘弹性状态(应变振幅γ=50,其中G′′>G′),紧接着在37°C下以0.1%的应变振幅(在线粘弹性范围内)进行时间扫描实验。图4a演示了瞬时凝胶回收率,前提是在温度平衡至37°C后,存储模量以损失模量为主。图4b显示了不同剪切速率和温度下的后续剪切粘度步骤。
总之,作者的目标是在37°C下形成强凝胶作为仿生基质,以宿主细胞并促进球状体的形成和生长。理想的生物墨水应构成软凝胶,由于其轻微的粘性,可以很容易地与细胞混合,并在室温下的打印过程中保护它们(图5)。


图5 5 wt% NaALG-g-P(NIPAM86-co-NtBAM14的粘度变化)含和不含Ca2+的水凝胶


作者还评估了水凝胶侵蚀,因为它是生物医学应用的重要参数,包括受控药物释放分析,侵蚀驱动的扩散率以及细胞封装和释放。如图5c所示,单交联水凝胶的侵蚀速度明显快于双交联水凝胶。还研究了热响应性水凝胶的溶胀率(图5d)。将凝胶浸入在37°C的PBS和PBS/Ca2+溶剂中。在37°C下,PBS中无钙热响应材料的吸水率随时间显着增加,具有最高的溶胀能力(9000%)。

图6 生物材料油墨的扩散比例


上述水凝胶再次3D打印,首先在打印机的加热床上,在37°C下,在室温下连续在床上,并评估生物材料油墨的扩散比例。铺展比是通过将线宽除以针内径来定义的,如图6a。通过注射策略,样品在不同温度下的粘性作为球状体的潜在载货具有重要作用。粘度较低的凝胶在注射过程中需要较小的剪切应力来转移细胞,并且聚合物基质在20或37°C下的独特侵蚀曲线可能表明在以后的细胞/球状体3D打印过程中具有不同的细胞球状体释放曲线。
在本研究中,离子和热交联机制的相互作用显着增强了凝胶在非常温和的条件下的功能和机械性能(弹性模量、抗侵蚀性和溶胀控制),而不会影响所得材料的可注射性/可印刷性。

图7 水凝胶中的细胞活力和生长


最后,为了评估作者开发的水凝胶对细胞活力和细胞形成特性的影响,作者进行了一系列3D生物打印细胞培养实验。在图7a中,来自光学显微镜的图像显示细胞在第1天均匀地分布在整个水凝胶中,而在后来的时间点上观察到3D球体的形成。与细胞系不同,延长至15天的培养时间长达15天并未显示出人类来源的单细胞形成的球状体的进一步生长,细胞系HEK293T由于不受控制的细胞分裂(永生化细胞系)而具有相同的接种密度形成更大的球状体,因此作者在第7天结束了对球状体的观察。

根据这些观察结果,作者进行了一系列检测,以研究3D细胞培养物中的细胞活力和增殖。发现细胞在两种生长培养基中以不同的节律增殖,通过对EdU染色表示(图7b)。第7天样品的EdU染色所指示的增殖能力表明,研究中使用的两种培养基之间的增殖速率容量存在差异。

图8 细胞培养基代谢物分析


为了进一步证明该系统可以支持水凝胶内的细胞生长,对葡萄糖、乳酸和乳酸脱氢酶(LDH)等代谢物进行了额外的代谢分析。从图8a中可以看出,葡萄糖消耗在所有鉴定的样品中都发生了,葡萄糖消耗量在相应对照基线的不同时间点逐渐减少。

图9 球状体形态学分析


最后,作者通过对DAPI染色对共聚焦显微镜获得的图像进行球状体形态学分析,并在第3天采集phalloidin. 3D重建的图像(图9a),以检查在两种培养基中培养的水凝胶中球状体的空间分布。通过可视化F-肌动蛋白,作者旨在研究球状体的边界,同时对细胞核进行染色,为作者提供了有关球状体细胞密度的信息。作者比较了第3天与第7天球体的测量直径,以证明球体形成动力学(图9c)。虽然在这两个组之间没有发现每个球体中测量的细胞数量在统计学上存在差异(图9e),但观察到每个球体细胞数量的不均匀分布,这进一步验证了这些细胞在3D培养环境中的特征异质性。作者还证明,即使使用极低的起始细胞密度,hPDC细胞仍然具有形成球状体的能力,并且存活长达7天。

结论:本文重点介绍了基于海藻酸钠接枝共聚物的双交联3D打印生物墨水的发展。海藻酸盐骨架促进了聚合物网络内原位球体的快速形成,而可逆凝胶崩解使球体易于回收,而不影响其活力和致密性。最后,发现温和的双交联机制显着放大了动态机械性能,从而形成了适用于3D打印功能性活细胞群的稳健聚合物网络。作者提出的方法允许在温和条件下开发具有自愈和剪切稀化特性的聚合物网络,以便可以承载和促进细胞球状体形成,从而能够在各种生物医学应用中利用这些生物材料作为细胞球状体封装剂用于药物筛选、微组织形成、3D体外建模和可注射治疗。

原文链接:https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2023.120790


关键词:3D打印生物墨水

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