清华大学的熊卓、张婷和方永聪教授：基于卫星在轨打印三维肿瘤模型

      太空三维（3D）生物打印技术可实现精确仿生肿瘤模型构建，用于评估空间环境对肿瘤的复合影响，进而深入了解疾病进展和相关治疗策略。目前太空三维生物打印面临一些困难，如发射前的不确定性、液体可能泄漏、太空中如何长期培养、设备自动控制、数据采集和传输等。近日，来自清华大学的熊卓、张婷和方永聪教授团队进行了基于卫星在轨打印三维肿瘤模型的相关研究。研究成果以“Satellite-Based On-Orbit Printing of 3D Tumor Models”为题于12月25日发表在《Advanced Materials》上。
      本文开发了一种结构强度高、体积小、重量轻（<6千克）的新型太空三维生物打印设备。基于微凝胶的双相热敏生物墨水和悬浮介质，可支持复杂肿瘤模型的在轨打印和原位培养。此外，本文还开发了一种智能控制算法，能够自动控制三维打印、自动对焦、荧光成像和数据地面传输。本研究为首次通过卫星在太空中实现肿瘤模型在轨打印，其形态稳定，存活率适中。结果发现，三维肿瘤模型在太空中比在地球上对抗肿瘤药物更敏感。本研究为太空三维生物打印开辟一条新途径，为未来太空生命科学和医学研究提供新的可能性。

本文从以下几个方面进行详细描述：
1. 太空三维生物打印设备开发
2. 适用于太空环境的功能性MBT生物墨水
3. 适合太空环境的多功能MBT悬浮介质
4. 基于机器学习的自动对焦算法
5. 复杂肿瘤模型在轨三维打印
6. 抗肿瘤药物检测

本文开发了一种小型和自动化的空间三维生物打印设备，体积小（220毫米×250毫米×150毫米），重量轻（≈6千克），适用于无人卫星平台（图1）。所开发的设备可自动控制三维打印、自动对焦和荧光成像，实现质量保证和及时反馈。此外，本文开发了一种嵌入式打印策略，支持在轨三维打印和复杂模型的长期培养。基于微凝胶的双热敏（MBT）生物墨水和悬浮介质，具有优异的存储性能和抗泄漏性，可适应潜在的发射延迟和振动。研究人员在低地轨道卫星上成功实现复杂肿瘤模型的在轨打印，其形态稳定，细胞存活率适中。本文还证明三维肿瘤模型在太空比在地球上对抗肿瘤药物更敏感，将加速未来太空肿瘤生物学和医学研究。

受限于目前火箭发射高昂成本及卫星有效载荷体积和重量限制，太空生物打印设备必须非常紧凑、轻便且结构强度高。因此，研究人员开发了一种尺寸仅为220毫米×250毫米×150毫米、重量仅为6千克的太空生物打印设备，用于在轨打印复杂肿瘤模型。太空生物打印装置主要由三维打印模块、生物模组、显微镜模块和控制模块组成（图2A）。三维打印模块主要由两个装满生物墨水的注射器和一个与加热片相连的硅绝缘体组成。生物模块由两个大室（体积：1.2±0.2mL）和八个小室（体积：0.4±0.1mL）组成，大室中装有用于嵌入打印的悬浮培养基，小室中装有用于研究空间肿瘤模型药物反应的癌症组装体和培养基。生物模块安装在可加热的上下平台上，而打印模块则安装在XY运动平台上，旁边是一个由电机控制的注射器活塞，用于将含有细胞的生物墨水挤压成复杂的三维结构。生物模块与三维打印模块相连，并通过乳胶软膜密封（图2D），软膜的厚度经过进一步优化。在打印模块和生物模块的外壁安装了温度传感器，以监测不同模块温度变化。在整个在轨打印和培养过程中，打印模块和生物模块的外部温度分别保持在21±2和32±2°C。因此，打印过程中MBT生物墨水和悬浮介质的实际温度分别保持在32±2℃和35±2℃。在地球上的反复测试表明，内部和外部组件之间的温差是恒定的。卫星进入轨道后，打印模块和生物模块在控制模块的驱动下加热到设定温度，然后该设备通过三维打印模块对肿瘤模型进行在轨三维打印（图2E）。打印完成后，显微镜模块自动捕捉生物样本的明视野和荧光图像，并将其传输到卫星，然后再传输到地面（图2F）。在火箭发射过程中设备可能会经历剧烈振动，持续时间约为一分钟，因此需要高强度和刚度。本文对设备的结构设计进行优化，确保有效载荷装置既坚固又轻巧。总之，本研究设计出了一种紧凑、集成、可靠的装置，能够进行在轨三维打印、观测和培养，为未来太空实验奠定基础。

考虑到在卫星中无人操作和传统挤压式三维生物打印的固有局限性，原位培养过程通常很难进行灌注。主要因为在液体灌注过程中，气液界面容易产生大量气泡。因此，研究人员开发了一种嵌入式三维生物打印策略，利用一种悬浮培养基既能三维打印MBT生物墨水，又能原位培养打印出的肿瘤模型（图3A）。MBT悬浮培养基由分散相GelMA凝胶和连续相明胶及透明质酸（HA）复合材料组成。结果表明，MBT悬浮培养基可用于高保真打印复杂结构（图3B）。荧光成像显示，MBT悬浮介质主要由类似于MBT生物墨水的微凝胶组成。流变测试表明，MBT悬浮介质具有剪切稀化和自愈合特性（图3C），有利于嵌入式打印。对嵌入打印的螺旋结构进行定量测量表明，丝的宽度和间距受打印温度影响不大（图3D、E），表明MBT悬浮介质具有较宽的打印温度范围。虽然微颗粒大大降低MBT悬浮介质的不透明度，但嵌入打印结构的轮廓仍清晰可见。研究人员还打印了人体解剖结构（如人的支气管和心脏，图3F）和带有悬臂的结构（如垂直的TH管，图3G），用于展示打印能力。使用传统的挤压打印方法很难打印出具有悬臂和薄壁等复杂结构的构造物。由于明胶的存在，MBT悬浮介质在加热阶段的凝胶-溶胶转变点为35°C，在冷却阶段的溶胶-凝胶转变点为20°C。将MBT悬浮培养基注入生物模块后，在4℃下迅速凝固。凝胶化后，MBT悬浮介质即使倒置也不会在容器内流动。采取这种预防措施是为了防止MBT悬浮介质在半开放舱内泄漏，在火箭发射过程中的剧烈振动可能会导致这种泄漏发生。在37℃的MBT悬浮培养基中培养的打印构建体在72小时内保持较高的细胞活力。以上结果表明，MBT悬浮培养基可支持复杂构建物在30-37°C下嵌入打印和原位培养，同时在4°C-25°C下经受长途运输而不会发生泄漏。

接着本文研究了太空环境中肺癌细胞对化疗药物的反应。有报道称微重力可调节化疗药物的作用，但这些研究都是在二维培养条件下使用微重力模拟装置进行的，因此得出的结论并不完全可靠。本文设计了一个生物模块，其中有一个装有顺铂敏感和顺铂抗性H460/CAF癌细胞组装体的8孔室。该癌细胞组装体是评估药物抗肿瘤能力的最佳三维肿瘤模型。敏感组和耐药组都接受不同剂量的顺铂治疗。通过液滴微流体技术，使用GFP标记的H460癌细胞和Dil标记的CAF生成直径200μm的癌细胞组装体。为增强聚焦效果，将癌细胞组装体嵌入薄层GelMA水凝胶中，然后进行光交联，使其附着在培养室底部。荧光染色（图4C）和组织学染色（图4D,E）显示，培养一周的癌细胞组装体发育成肿瘤组织样结构，肿瘤实质和基质成分围绕着实质癌细胞，与体内肿瘤组织相似。为研究太空环境对肿瘤对药物治疗反应的影响，在地面和太空同时捕获明视野和荧光图像。结果发现，顺铂耐药组和顺铂敏感组在空间环境给药36小时后都出现明显反应。在太空中比在地球上更加迅速和敏感（图4F）。太空环境中的耐药组比药物敏感组对顺铂的耐药性更强（图4G-J）。本研究结果表明，空间微重力环境可能会大大提高细胞对化疗药物的反应性，从而使耐药细胞更容易进行抗肿瘤治疗。这一发现为解决肿瘤耐药性问题提供一种新方法。要确定空间辐射和微重力对肿瘤治疗敏感性的不同影响，还需要进一步的研究。研究人员计划不久将来在中国空间站上进行全面的实验验证。

总结与展望
总之，本文开发了一种新型适用于太空的生物打印设备，可以在太空中打印和培养三维肿瘤模型。研究结果表明，所开发的MBT生物墨水和MBT悬浮培养基能够在很宽的温度范围内打印三维肿瘤模型，并能在轨道上实现形态稳定、细胞活力适中的培养。本文在卫星上对多功能实验装置和太空生物打印技术成功进行了在轨验证，标志着太空三维生物打印技术的发展迈出重要一步，为加速太空生物学和医学研究与发展提供新的机遇。

文章来源：https://doi.org/10.1002/adma.202309618